ELISA 標(biāo)準(zhǔn)操作及技術(shù)服務(wù)的常見問題
ELISA 標(biāo)準(zhǔn)操作要點
優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于 1.5μs/cm。
標(biāo)本的采取和保存
大部分 ELISA 檢測均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP 為標(biāo)記的 ELISA 測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性 HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。一般說來，在 5 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于 4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清 IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。 抗凝不*的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素
抗凝劑。
ut off 值附近血清的處理
1.cut off 值附近的值是客觀存在的
cutoff 值指經(jīng)過大量臨床調(diào)查后自行制定的判斷陰陽性的界限。Cut off 值附近的值客觀存
在基于以下原因：大量臨床陰性樣本 A 值呈正態(tài)分布；這些陰性樣本 A 值是由低到高的連
續(xù)曲線；cutoff 值是這個連續(xù)曲線上的截斷值。
1.1 正常血清 A 值的正態(tài)分布
95.46％
µ-2σ µ µ+2σ 圖一
當(dāng)試劑盒研發(fā)完成后，需要進行大量的臨床樣品的考核。其中陰性血清的 A 值呈正態(tài)分布，大約 95％的陰性血清值與平均值相近，而有 5％的陰性血清則明顯低于或高于平均值，這是 cutoff 值可根據(jù) 95％的置信限來確定。若試劑盒的特異性很好，可用 98％作為置信限來確定 cutoff 值。但不論是選擇多少的置信限，總存在置信限以外的區(qū)域，該區(qū)域的部分樣品 A 值會高于 cutoff 值，從統(tǒng)計上說是無法避免的。1.2 正常血清 A 值的連續(xù)分布經(jīng)過大量的臨床調(diào)查會發(fā)現(xiàn)，正常血清的 A 值是一條從小到大的連續(xù)曲線。在這條連續(xù)的曲線上，經(jīng)過計算選取一點作為 cutoff 值，這一點之下為陰性，之上為陽性，因此 cutoff 值附近的值是必然存在的。
2.怎樣對待 cutoff 值附近的血清
2.1 本公司試劑盒有很好的敏感度和特異性，不提倡設(shè)置灰區(qū)，堅持按照說明書要求，大于等于 cutoff 的為陽性。
2.2 某些檢驗單位有劃灰區(qū)的習(xí)慣，灰區(qū)一般是在相應(yīng)的 cutoff 以下 8％－10％范圍內(nèi)，國家并沒有一定的規(guī)定，對于一定要設(shè)置灰區(qū)的單位，本公司建議在我們的 cutoff 值以下 10％為灰區(qū)。值得注意的是本公司的 HCVcutoff 是變化的，所以灰區(qū)也應(yīng)是變化的。
2.3 對于可疑樣本可采用多次數(shù)檢驗的方法作為陰陽性判斷的依據(jù)。如進行 5 此重復(fù)性試驗，有 3 次為陽性，2 次為陰性，判斷樣本為陽性
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