了解細菌鑒定中的一些反應
1、實驗儀器,材料和用具:
(1)實驗儀器:
37℃恒溫培養(yǎng)箱、20℃恒溫培養(yǎng)箱(室溫代替).
(2)微生物材料:
大腸桿菌、變形桿菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣桿菌這四種菌種的斜面各1支.
(3)試劑:
甲基紅試劑、VP試劑、叫噪試劑、格里斯試劑(硝酸鹽利用試驗)、盧戈氏碘液(淀粉水解試驗)
(4)實驗用具:
試管:每份每個試驗2根試驗,1 根對照,8個試驗共27根.
無菌平皿:每份2個
杜氏小管:每份6個.
接種環(huán)、酒精燈、試管架、記號筆.
(5)培養(yǎng)基:
①葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基:何份各6支試管,何支5 一10mi 培養(yǎng)基,滅菌.用于糖類發(fā)酵試驗.
②葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基:每份3 支試管,何支5一10mi培養(yǎng)基,滅菌.用于甲基紅和VP試驗.
③胰蛋白水培養(yǎng)基:每份3支何支5一10mi培養(yǎng)基,滅菌.用于叫睬試驗.
④檸檬酸鐵錢或醋酸鉛的半固體培養(yǎng)基;每份3 支,每支5 一10ml 培養(yǎng)基,滅菌.用于硫化氫試驗.
⑤營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基:每份3支,每支5一10ml培養(yǎng)基、滅菌.用于明膠液化試驗.
⑥淀粉培養(yǎng)基:每份2個平皿,每平皿約20ml培養(yǎng)基,滅菌后倒入平皿.用于淀粉水解試驗.
⑦檸檬酸鈉培養(yǎng)基:每份3支,每支5 一10ml培養(yǎng)基,滅菌,做斜面.用于檸檬酸鹽利用試驗.
3、實驗步驟:
(1)糖(醇)類發(fā)酵試驗:
編號在各試管上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱,所接種的菌名和組號,下同.
接種取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基3支,按編號1 支接種大腸桿菌,另1支接種普通變形桿菌,第3支不接種,作為對照C同樣取3支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基,1支接種大腸桿菌,1支接科普通變形桿菌,第3支不接種,作為對照.
將己接種好的培養(yǎng)基置37℃溫箱中培養(yǎng)24h.
觀察結果:被檢細菌若能發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖時,則使培養(yǎng)基的pH 降低,這時培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(為黃色),若發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,則培養(yǎng)基不僅顯酸色反應,并且在培養(yǎng)基中倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有氣體.氣體占整個倒置小玻管的10％以上.若被檢細菌不分解培養(yǎng)基中的糖,則培養(yǎng)基不發(fā)生變化.
(2)甲基紅試驗(MR試驗):
將大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌分別接種到葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48h,加甲基紅指示劑數(shù)滴,觀察結果,呈現(xiàn)紅色者為陽性,呈現(xiàn)黃色者為陰性.
(3)伏一普二氏試驗(VP試驗):
將被檢菌接種到葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48h ,取出,加入40 % KOlls一10滴,然后再加入等量的5％.一蔡酚溶液,用力振蕩,再放入37℃溫箱中保溫巧一30min ,以加快反應速度.若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色,為伏一普反應陽性.
(4)靛基質(口引噪)試驗:
將被檢菌接種到胰蛋白陳水培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h 一48h 后,沿試管壁滴加數(shù)滴叫睬試劑于培養(yǎng)物液面,觀察結果.
出現(xiàn)紅色者為陽性,出現(xiàn)黃色者為陰性.
(5)硫化氫試驗:
將大腸桿菌和變形桿菌以接種針穿刺接種到醋酸鉛或檸檬酸鐵氨培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h ,觀察結果,若有黑色出現(xiàn)者為陽性.
(6)明膠液化試驗:
取大腸桿菌和枯草桿菌的純培養(yǎng)物少許,以接種針分別穿刺接種到營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基中,置20℃培養(yǎng)5 一7 天.觀察明膠培養(yǎng)基液化情況.若被檢細菌20℃不易生長,可放37℃培養(yǎng),但在此溫度下明膠培養(yǎng)基呈液狀,故觀察結果時,應將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4℃冰箱30min ,此時明膠又凝固.若放置于冰箱30min仍不凝固者,說明明膠被試驗細菌液化,是為陽性.
(7)淀粉水解試驗:
將配制好的淀粉培養(yǎng)基冷卻到50℃左右,以無菌操作制成平板.
用接種環(huán)取少許枯草桿菌劃線接種在平板的一邊,再取少許大腸桿菌劃線接種在平板的另一邊.置37℃溫箱培養(yǎng)24h.
將平皿取出,打開皿蓋,滴加少量盧戈氏碘液于平板上,輕輕搖動平皿,使碘液均勻鋪滿整個平板.如菌苔周圍有無色透明圈出現(xiàn),說明淀粉己被水解.透明圈的大小,說明該菌水解淀粉能力的大小.
(8)檸檬酸鹽利用試驗:
取少量被檢菌接種到檸檬酸鹽培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h后,觀察結果.培養(yǎng)基變深藍色者為陽性.培養(yǎng)基不變色,則繼續(xù)培養(yǎng)7天,培養(yǎng)基仍不變色者為陰性.
2、實驗原理:
(1)、細菌生化試驗:
各種細菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同,對營養(yǎng)基質的分解能力也不一樣,因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區(qū)別,可供鑒別細菌之用.用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質的代謝作用及其代謝產(chǎn)物,從而鑒別細菌的種屬,稱之為細菌的生化反應.
(2)、糖(醇)類發(fā)酵試驗:
不同的細菌含有發(fā)酵不同糖(醇)的酶,因而發(fā)酵糖(醇)的能力各不相同.其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物亦不相同,如有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣,有的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣.酸的產(chǎn)生可利用指示劑來判定.在配制培養(yǎng)基時預先加入溟甲酚紫［P HS. 2(黃色)一6 . 8 (紫色)],當發(fā)酵產(chǎn)酸時,可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色.氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來證明.
(3)、甲基紅(Methylred)試驗(該試驗簡稱MR試驗):
很多細菌,如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸再被分解,產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等,使培養(yǎng)基的pH 降低到4 . 2 以下,這時若加甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色.因甲基紅指示劑變色范圍是pH4 . 4 (紅色)一pH6 . 2 (黃色).若某些細菌如產(chǎn)氣桿菌,分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,但很快將丙酮酸脫梭,轉化成醇等物,則培養(yǎng)基的pH 仍在6 . 2 以上,故此時加入甲基紅指示劑,呈現(xiàn)黃色.
(4)、大分子物質代謝實驗:
靛基質(口引睬)試驗:
某些細菌,如大腸桿菌,能分解蛋白質中的色胺酸,產(chǎn)生靛基質(叫睬),靛基質與對二甲基氨基苯甲-醛結合,形成玫瑰色靛基質(紅色化合物).
硫化氫試驗:
某些細菌能分解含硫的氨基酸(肌氨酸、半肌氨酸等),產(chǎn)生硫化氫,硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽,形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵.為硫化氫試驗陽性,可借以鑒別細菌.
明膠液化實驗:
某些細菌具有膠原酶,使明膠被分解,失去凝固能力,呈現(xiàn)液體狀態(tài),是為陽性.
粉水解試驗(在紫外誘變中做,本實驗不做):
細菌對大分子的淀粉不能直接利用,須靠產(chǎn)生的胞外酶(淀粉酶)將淀粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖(或麥芽糖),再被細菌吸收利用,細菌水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明,即用碘測定不再產(chǎn)生藍色.
(5)、有機酸鹽及氨鹽利用試驗:
檸檬酸鹽利用試驗:
檸檬酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基,其中檸檬酸鈉為碳的唯-一來源.而二氫按是氮的唯-一來源.有的細菌如產(chǎn)氣桿菌,能利用檸檬酸鈉為碳源,因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長,并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性.此時培養(yǎng)基中的溟廖香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樯钏{色.不能利用檸檬酸鹽為碳源的細菌,在該培養(yǎng)基上不生長,培養(yǎng)基不變色.
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