ELISA試劑盒是什么
酶聯(lián)免疫吸附試驗(enayme liked immunosorbent,ELISA)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種檢測技術(shù),因其具有敏感性高、特異性強、操作簡單等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測定,為輔助診斷與生物科研起到了積極的作用。但在ELISA的測定過程中,影響其測定結(jié)果的因素較多,操作過程每個環(huán)節(jié)都會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響,導(dǎo)致錯誤的測定結(jié)果。
ELISA試劑盒操作步驟
試劑的準(zhǔn)備
目前各種ELISA試驗均有商品化的試劑盒。應(yīng)選擇質(zhì)量優(yōu)良、有批準(zhǔn)文號且在有效期內(nèi)的檢測試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進行實際操作。從冰箱中取出的試劑應(yīng)放在室溫下或37℃平衡30min再進行測試。保存試劑盒的冰箱應(yīng)經(jīng)常檢查儲存溫度并做好記錄，冰箱應(yīng)避免頻繁開關(guān)。試劑使用前應(yīng)搖勻。
標(biāo)本的采集和保存
ELISA試驗所用標(biāo)本主要為血清，也可以用經(jīng)過預(yù)處理的唾液、尿液、糞便等生物材料?；颊邩?biāo)本可能含有干擾試驗的免疫物質(zhì)，導(dǎo)致假陽性或者假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素包括類風(fēng)濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過選擇合理的試劑。外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、儲存時間過長及標(biāo)本凝固等。在血液采集和運輸過程時，應(yīng)注意避免溶血。否則，紅細(xì)胞溶解時會釋放出血紅蛋白，血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標(biāo)記的ELISA試驗測定中，可能會增加非特異性顯色而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。血清標(biāo)本適宜在新鮮時檢測，若推遲檢測需將標(biāo)本低溫保存。一般說來，在7天內(nèi)檢測的血清標(biāo)本，可放置于2℃~8℃保存，超過1周檢測的需低溫冰存。因反復(fù)冰融會使抗體效價降低，所以，對需要保存做多次抗體測定的血清標(biāo)本，應(yīng)少量分裝并冰存。血清標(biāo)本應(yīng)充分離心，否則可因殘留的纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。
加樣操作中，依次有3次加樣，即加標(biāo)本、加酶結(jié)合物、加底物。加標(biāo)本一般采用手工加樣或者加樣器。手工加樣每次必須更換吸嘴，以避免交叉感染。要掌握好并在實際操作中揣摩使用技巧，避免吸樣量過多或過少。加樣器在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，因此必須定期對加樣器進行維護和校準(zhǔn)。加酶結(jié)合物和底物一般可直接滴加。每次加樣時，應(yīng)將所加物置于ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，注意不可濺出，不能產(chǎn)生氣泡，加酶試劑后要用吸水紙在酶標(biāo)板上輕輕擦拭吸干。加底物操作時應(yīng)注意各試劑盒顯色劑不能混用，添加順序不能顛倒，不能濺出孔外。標(biāo)本較多時，需要分批操作，以免加樣板過多，造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(尤其是在室溫較高時)。zui后，在微型振蕩器上震蕩lmin，以保證混勻。
溫育
ELISA反應(yīng)是抗原、抗體的結(jié)合在固相表面上發(fā)生的一系列的反應(yīng)，抗原抗體結(jié)合是一個逐步平衡的過程，需要經(jīng)過擴散才能達到反應(yīng)的終點，因此ELISA反應(yīng)需要一定時間的溫育。溫育也是影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，尤其是對弱陽性標(biāo)本影響zui為明顯[2]。溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好地解決因受熱不均衡所致的周圍孔與孔結(jié)果的吸光度差異(即“邊緣效應(yīng)”)。溫育常采用的溫度是43℃、37℃、室溫和4℃，其中zui常用的是37℃，也是大多數(shù)抗原抗體反應(yīng)的適合溫度。為了保證各板的溫度能迅速平衡，可將反應(yīng)板放在水浴箱中，漂浮在水面上，但反應(yīng)板不應(yīng)疊放。為避免標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)而吸附于孔壁，反應(yīng)板應(yīng)加蓋或貼封紙。注意溫育的溫度和時間，應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確無誤。因為孵育時間過長，可以出現(xiàn)非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*，導(dǎo)致花板。
洗滌
洗滌是ELISA不同于均相免疫學(xué)檢測技術(shù)的一大特征，洗滌在整個ELISA反應(yīng)過程雖不是一個反應(yīng)步驟卻非常關(guān)鍵。操作者應(yīng)嚴(yán)格按照要求洗滌，因為ELISA試驗就是依靠洗滌來達到分離游離的酶標(biāo)記物和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌，可以清除殘留在板孔中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。采用自動洗板機洗板，洗板機設(shè)置時間、間隔、次數(shù)要保持一致，不能過多或過少。洗板次數(shù)較少，造成殘留，引起假陽性結(jié)果。洗板次數(shù)過多，可造成抗原抗體結(jié)合物洗脫，造成假陰性結(jié)果[3]。要保證洗液注滿各孔，防止在反應(yīng)孔中形成氣泡而造成洗滌不充分。洗板結(jié)束后，在干凈無塵的吸水紙上輕輕拍干。如洗液量不足可致洗板不*，洗板針堵塞，抽吸不*，洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。
顯色
顯色是ELISA試驗中zui后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。適當(dāng)提高溫度，有助于加速顯色。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。在定量檢測中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。ELISA顯色結(jié)果通過酶標(biāo)儀進行，可減少實驗誤差，提高臨界值樣本的分析準(zhǔn)確度。盡量避免肉眼直接判斷結(jié)果，因為不同個體的視覺存在差異。應(yīng)注意，加顯色劑時，要保持顯色劑不外流。加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生較多氣泡，否則可能使假陽性結(jié)果的出現(xiàn)概率增加。
比色
比色的方法有目視法和酶標(biāo)比色法2種。目視法簡單明了，但對同一標(biāo)本，操作者的不同有時會出現(xiàn)不同的結(jié)果，具有一定的主觀性。比色的結(jié)果通常用光密度表達，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度表達。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時的適宜室溫在15℃~30℃之間，使用前要先預(yù)熱儀器15~30min，使測得結(jié)果更為準(zhǔn)確。比色前，應(yīng)先用潔凈的吸水紙擦拭干凈板底附著的液體，然后將板正確放在酶標(biāo)比色儀的比色架上。綜上所述，的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。在實際應(yīng)用過程中，操作者必須熟練掌握基本操作技能，對每個環(huán)節(jié)進行嚴(yán)格仔細(xì)的核查，盡量避免假陽性和假陰性反應(yīng)的出現(xiàn)，保證檢測結(jié)果真實可靠，為診斷和疾病防治提供可靠的理論依據(jù)。
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