信帆生物針對WB常見問題在線解答
蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB )是很常規(guī)的生物學(xué)實驗，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
1、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？
答：可能的原因有：
1）細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；
2）抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；
3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時間過長；
4）細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。
2、我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？
答：1）可以加大抗原上樣量，這是主要的；
2）也可以將一抗稀釋比例降低；
3）還可以延長曝光時間。
3、我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KD），請問怎么做WB？
答：1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；
2）也可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
4、大分子量蛋白200KD，在做WB要注意什么？
答：1）做200kd蛋白的WB時要注意，分離膠選擇>7%的；剝膠時要小心；
2）轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）；
3）轉(zhuǎn)膜液甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦!
5、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
6、WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？
答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。
7、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到佳效果？
答：無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。
8、免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？
答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。
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