狂犬N蛋白(NP)包被抗體該病毒具有較強的神經(jīng)組織嗜性,是致死性傳染病-狂犬病的病原體。狂犬病病死率很高,目前尚無有效治療藥物。我國是狂犬病嚴重流行國家之一,近年來,我國狂犬病呈快速上升趨勢,形成了自1950年以來的第三次大流行。因此建立狂犬病毒安全、快速并特異的實驗室檢測方法以提高狂犬病的實驗室監(jiān)測能力對狂犬病的防控非常必要。 狂犬病毒含5個結(jié)構(gòu)蛋白,其中N蛋白是狂犬病毒的主要組成部分,其一級結(jié)構(gòu)高度保守,存在著較高的狂犬病毒屬的抗原交叉性,常作為狂犬病毒篩查和診斷應(yīng)用的檢測用抗原。pFastbac-to-bac桿狀病毒表達系統(tǒng)通過外源基因特異性位點的轉(zhuǎn)座作用可對外源基因進行高效的表達。該系統(tǒng)除了具有傳統(tǒng)桿狀病毒表達系統(tǒng)產(chǎn)量高、易純化、安全性高、對翻譯后蛋白進行加工修飾等優(yōu)點,還能利用表達載體N端多聚組胺酸標簽對目的蛋白進行純化。因此本研究選擇pFastBac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)對狂犬病病毒標準攻擊強毒株(CVS-11)N基因進行表達,為檢測試劑的研發(fā)和進一步建立實驗室檢測方法奠定基礎(chǔ)。本實驗應(yīng)用RT-PCR方法擴增獲得CVS-11 N基因片段,克隆入桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBac中,構(gòu)建克隆有CVS-11 N基因的重組質(zhì)粒pFastBac-N;將pFastBac-N轉(zhuǎn)化DH10Bac E.coli感受態(tài)細胞,獲得CVS-11 N基因桿狀病毒重組表達質(zhì)粒Bacmid-N;脂質(zhì)體介導(dǎo)Bacmid-N轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞,60h后Sf9細胞出現(xiàn)了明顯病變,提取轉(zhuǎn)染后細胞DNA,PCR鑒定結(jié)果表明成功獲得了表達CVS-11株N基因的P1代重組桿狀病毒(AcMNPV-N)。 AcMNPV-N連續(xù)接種兩代細胞擴增病毒,獲P3代AcMNPV-N感染Sf9單層細胞,40h后收獲細胞進行DFA、SDS-PAGE和Western-blot鑒定。

狂犬N蛋白(NP)包被抗體

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